Nie było wstępnej selekcji dla przypadku ani próbek kontrolnych z określonymi klinicznymi endofenotypami. Wybrane próbki przypadków reprezentowały prawie całą tkankę odpowiednią do badania w Brain and Tissue Bank for Developmental Disorders w National Institute of Child Health and Human Development oraz Harvard Tissue Resource Center (patrz Dodatek Aneks do dalszego opisu kryteriów wykluczających ). Próbki, które przeszły kontrolę jakości, obejmowały 22 bloki grzbietowo-bocznej kory przedczołowej (od ośmiu chłopców i trzech dziewczynek w każdej grupie), 5 bloków tylnej kory czołowej górnej (2 próbki z chłopców i 3 próbki kontrolne od chłopców) i 6 bloków kory potylicznej (3 próbki przypadków od chłopców i 3 próbki kontrolne od chłopców) (średnia [. SD] liczba integralności RNA, 7,10 . 1,74 dla próbek przypadku, 7,04 . 1,71 dla próbek kontrolnych) (rysunek 1A). Fenotypowanie oparte na markerach
Studium I
Każda próbka grzbietowo-bocznej kory przedczołowej (8 próbek przypadku i 8 próbek kontrolnych od chłopców) była seryjnie kriogenizowana (grubość 20 .m) w płaszczyźnie przekroju zawierającego wszystkie warstwy korowe (Figura 1B). Skrawki pogrupowano w 10 serii po 30 sekcji na serię; 24 skrawki oznakowano za pomocą markerów do hybrydyzacji in situ, 2 skrawki wybarwiono Nisslem do analizy anatomicznej i komórkowej cytoarchitektonicznej, a 4 skrawki pozosta- wiono bez wybarwiania do przyszłego użycia. Zmodyfikowaliśmy metody zautomatyzowanej, wysokoprzepustowej hybrydyzacji in situ i akwizycji obrazów cyfrowych z pełnym ślizgiem, w celu przetwarzania pośmiertnych próbek młodej, poporodowej, świeżo mrożonej tkanki mózgowej.
Badanie II
Grupowaliśmy każdy blok i stosowaliśmy hybrydyzację in situ do oznaczania próbek kory przedczołowej grzbietowo-bocznej z 3 próbek przypadku i 3 próbek kontrolnych od dziewcząt, a także tkanki od kory czasowej od chłopców (2 próbki przypadków i 3 próbki kontrolne) i kory potylicznej od chłopców (3 próbki przypadków i 3 próbki kontrolne) do oznaczenia ekspresji pięciu genów: CALB1, RORB, PCP4, PDE1A i NEFL. Geny te reprezentują podgrupę genów, które wykazały silne zmiany w próbkach przypadku od chłopców, które były analizowane w badaniu I. (Zobacz sekcję Metody w Dodatkowym dodatku, aby uzyskać dalsze szczegóły dotyczące wyboru genu.)
Ocena wyrażenia markera
Uzyskaliśmy wszystkie dane uzyskane przez hybrydyzację in situ dla każdego genu na każdej próbce przy użyciu 3-punktowej skali: 0 dla normalnej, dla łagodnej anomalii i 2 dla ciężkiej anomalii. Próbka została uznana za nienormalną, jeśli zidentyfikowaliśmy co najmniej jedno z następujących trzech kryteriów w trzech lub więcej sąsiadujących sekcjach: intensywność ekspresji genów wydaje się być zmniejszona lub zakłócona w porównaniu z kontrolą w grupie kontrolnej; ekspresja genu była nienormalna z powodu jakościowej zmiany liczby znakowanych komórek, w porównaniu z liczbą w sąsiadujących obszarach; lub wzór ekspresji genów, który był specyficzny dla typu komórki lub warstwy, wydawał się nieprawidłowy w porównaniu z kontrolami
[patrz też: kursy fizjoterapia, pracownia emg, difenhydramina ]
Powiązane tematy z artykułem: difenhydramina kursy fizjoterapia pracownia emg