Aktywność ADA2 w surowicy pacjenta i ekspresja w komórkach ssaków
Analiza próbek surowicy od pięciu pacjentów, którzy byli homozygotyczni pod względem mutacji Gly47Arg wykazała, że aktywność ADA2 została zmniejszona o czynnik większy niż cztery, w porównaniu z kontrolami (P <0,001) (Figura 2C). W sześciu heterozygotycznych nośnikach Gly47Arg aktywność ADA2 w próbkach surowicy była podobna do tej w próbkach kontrolnych, co jest zgodne z brakiem choroby u nosicieli. W próbce surowicy od jednego pacjenta, który był złożony heterozygotycznie pod względem mutacji Arg169Gln i Pro251Leu, aktywność ADA2 była jeszcze bardziej zagrożona.
ADA2 była wyrażana egzogennie w komórkach ssaków, z nieumyślnymi i zmutowanymi konstruktami wyrażonymi na podobnych poziomach (Fig. S5 w Dodatku Aneks). W transfekowanych komórkach wydzielone poziomy ADA2 w pożywkach były znacznie niższe w przypadku zmutowanych białek niż w przypadku niezmutowanego białka; ADA2 było ledwo wykrywalne w komórkach wyrażających mutację Gly47Val lub Arg169Gln (Figura 2D i 2E). Analiza lizatów komórkowych z tych samych eksperymentów wykazała podwyższone ilości zatrzymanych wewnątrzkomórkowych zmutowanych białek Arg169Gln, Pro251Leu i Trp264Ser, w porównaniu z nieumytatywnym ADA2. W sumie proporcja całkowitej ilości ADA2 wydzielanego do pożywki była znacznie niższa w przypadku wszystkich zmutowanych białek niż w przypadku niezmutowanego białka (tabela S3 w dodatkowym dodatku).
Mniejsze proporcje mutanta w porównaniu z nieumotywującym ADA2 wykryte w pożywce mogą być spowodowane zaburzeniami sekrecji, zmienioną stabilnością zmutowanych białek lub obydwoma. Aby zbadać, czy mutacje ADA2 wpłynęły na właściwości strukturalne białka, rekombinowane ADA2 i mutanty Gly47Arg, Gly47Val i Trp264Ser ulegały ekspresji w komórkach S2 w delfozie, a następnie oczyszczano je z pożywki komórkowej.14 Jak widać w komórkach ssaków, poziomy zmutowanych białek ADA2 były znacznie niższe niż poziom nie zmutowanego białka ADA2 w pożywce z komórek S2 (ryc. S6 w dodatku uzupełniającym). Tylko Trp264Ser dawał wystarczającą ilość białka do analizy. Analiza biofizyczna Trp264Ser za pomocą kołowego dichroizmu wykazała zmniejszoną zawartość helikalną, wskazując mniej stabilną strukturę drugorzędową i zmniejszoną termostabilność (ryc. S7A i S7B w dodatku uzupełniającym). Zwiększone wiązanie barwnika fluorescencyjnego kwasu 8-anilino-1-naftalenosulfonowego wskazywało na częściowe rozwijanie tego zmutowanego białka (fig. S7C w dodatkowym dodatku).
Dyskusja
Nasze wyniki wskazują, że pokryta naczynioplazmą pokrywająca się guzkowa guzka może być spowodowana zmniejszoną aktywnością ADA2 z powodu recesywnych mutacji w genie kodującym ADA2 CECR1.
[patrz też: studia autyzm poznań, orteza stawu skokowego, diagnoza autyzmu ]
Powiązane tematy z artykułem: diagnoza autyzmu orteza stawu skokowego studia autyzm poznań